Для чего используют анализ ПЦР?

Суть метода ПЦР

Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR – polymerase chain reaction) – метод получения множества копий определенных фрагментов ДНК (генов) в биологическом образце.

Сущность ПЦР как метода молекулярной биологии заключается в многократном избирательном копировании определённого гена (участка ДНК) при помощи специальных ферментов в условиях in vitro. Важной особенностью ПЦР является получение копий конкретного участка ДНК (гена), соответствующего заданным условиям. Синонимом процесса копирования ДНК является «амплификация». Репликация ДНК in vivo также может считаться амплификацией. Однако в отличие от репликации, в процессе полимеразной цепной реакции амплифицируются короткие участки ДНК (максимум 40 000 пар нуклеотидов).

Основные принципы

Итак, ПЦР — это многократное копирование определенных фрагментов ДНК in vitro в процессе повторяющихся температурных циклов. Как же протекает процесс реакции в пределах одного температурного цикла?

Образование нуклеотидной цепи осуществляется ферментом ДНК-полимеразой. Однако для начала работы ферменту необходима стартовая площадка. В качестве площадок выступают «праймеры» (затравки) — синтетические олигонуклеотиды длиной 15-20 нуклеотидов. Праймеров должно быть два (прямой и обратный), они комплементарны участкам ДНК-матрицы и именно фрагмент ДНК, ограниченный праймерами, будет многократно копироваться ДНК-полимеразой. Работа полимеразы заключается в последовательном добавлении нуклеотидов, комплементарных последовательности ДНК-матрицы. Тем самым в одном температурном цикле вновь синтезируется два новых фрагмента ДНК (т.к. молекула ДНК — двуцепочечная, то и матриц изначально две). Таким образом, за 25-35 циклов в пробирке накапливаются миллиарды копий участка ДНК, определенного праймерами. Структуру отдельного цикла можно представить следующим образом:

  1. денатурация ДНК (плавление, расхождение цепей ДНК) — 95°С — 1 или 2 минуты;
  2. отжиг праймеров (затравки связываются с ДНК-матрицей, температура данной стадии определяется нуклеотидным составом праймера) — 60°С (к примеру) — 1 минута;
  3. элонгация ДНК (полимераза синтезирует цепь ДНК) — 72°С — 1 минута (время зависит от длины синтезируемого фрагмента).

Приборная база для применения метода полимеразной цепной реакции в лаборатории должна состоять из:

  1. амплификатора(или, как его еще называют, термоциклера);
  2. системы для гель-электрофореза с источником питания (для визуализации результатов ПЦР);
  3. системы гель-документации(для анализа результатов ПЦР);
  4. ПЦР-бокса(для пробоподготовки);
  5. вортекса;
  6. микроцентрифуги;
  7. набора автоматических дозаторов (механических или электронных).

Помимо основного и вспомогательного оборудования для полноценного функционирования ПЦР-лаборатории, необходимы некоторые расходные материалы: стерильные наконечники, пробирки, штативы для пробирок и дозаторов.

Реагентная база в обычной ПЦР-лаборатории для проведения полноценной полимеразной цепной реакции включает в себя фермент ДНК-полимеразу с буфером, праймеры (небольшие синтетические фрагменты ДНК, комплементарные началу и концу анализируемого участка ДНК-матрицы), смесь нуклеотидов (А, Т, Г, Ц). Также абсолютно необходима очищенная вода.

Достоинства метода ПЦР

Высокая чувствительность исследования

Чувствительность метода такова, что амплифицировать в ПЦР и выявить целевую последовательность можно даже в том случае, если она встречается однажды в образце из 10 5 клеток.

Специфичность анализа

ПЦР позволяет выявлять ДНК конкретного инфекционного агента в присутствии ДНК других микроорганизмов и ДНК организма-хозяина, а также проводить генотипирование. Специфически подбирая компоненты реакции (праймеры), Вы можете одновременно выявлять ДНК близкородственных микроорганизмов.

Универсальность метода ПЦР

Дело в том, что для ПЦР-диагностики инфекционных заболеваний, либо наследственных заболеваний человека можно использовать одно и то же оборудование, следовать универсальным процедурам подготовки образцов (проб) и постановки анализа, а также однотипные наборы реактивов.

Экономия времени

Важное преимущество ПЦР – отсутствие стадий культуральной микробиологической работы. Подготовка образцов, проведение реакции и анализ результатов максимально облегчен и во многом автоматизирован. Благодаря этому, время получения результата может сокращаться до 4-5 часов.

Эффективность метода ПЦР

ПЦР помогает избежать известных сложностей, возникающих при выращивании труднокультивируемых, некультивируемых или персистирующих форм микроорганизмов для диагностики латентных и хронических инфекций. Эффективен метод ПЦР и при скрининге возбудителей с высокой антигенной изменчивостью, а также внутриклеточных паразитов.

Широта исследуемого клинического материала

В качестве образца при полимеразной цепной реакции может быть использован не только биологический материал от больного, но также и многие другие субстраты, в которых могут быть идентифицированы молекулы ДНК с высокой чувствительностью, например, вода, почва, продукты питания, микроорганизмы, смывы и многое другое.

Все перечисленные выше достоинства этого уникального метода — высокая чувствительность и специфичность, идентификация инфекционного агента и проведение генотипирования любого гена человека, высокая эффективность и экономия времени, универсальность приборной базы – позволяют широко применять сегодня метод ПЦР в клинической диагностике, медицинской практике, научных исследованиях, контроле качества и многих других областях.

Применение ПЦР

Области применения полимеразной цепной реакции как современного метода молекулярной биологии разнообразны. Во многом это обусловлено широтой материала, который можно анализировать (практически все, из чего можно выделить более-менее качественую ДНК может стать объектом исследования), а также подобранных праймеров. Основные области применения ПЦР:

Анализ ПЦР

Пцр-диагностика: что это такое

Анализ пцр относительно молодой, ему около 30-ти лет. Данная методика исследования прошла все этапы эволюции и сегодня является одной из самых информативных. Смысл заключается в многократном увеличении ДНК искусственным образом. Осуществляется повторение той части, которая имеется лишь у определенной разновидности патогенного возбудителя.

Время воздействия составляет три минуты. Достаточно около тридцати таких этапов, чтобы вышло нужное число молекул для четкого выявления агента способом электрофореза.

Кроме этого медики сращивают части ДНК, выполняют различные мутации, что позволяет применять анализ пцр диагностику не только с целью выявления инфекционных и генетических нарушений, но и для подтверждения или опровержения родственных связей, клонирования и прочее.

Проведение пцр анализа осуществляется в специальных медицинских учреждениях с применением специализированной техники.

Расшифровка

Значения могут носить отрицательный либо положительный характер. В первом случае можно говорить о том, что никаких инфекций и патологий не выявлено, во втором, они обнаружены и человек заражен.

Часто позитивный результат наблюдается у носителей инфекций, но при этом люди себя абсолютно нормально чувствуют, ни на что не жалуются. Нужно отметить, что это ранняя стадия болезни, которая пока себя не проявила, нужна консультация доктора. Когда недуг был обнаружен, нужно обязательно предпринять терапевтические меры.

Пцр диагностика инфекций выступает на сегодняшний день самым точным исследованием и позволяет безошибочно определить наличие вредителя.

Подготовка к исследованию

Все зависит от разновидности изучаемого материала. Анализ крови пцр сдается в утреннее время на голодный желудок. Анализ кала на пцр и мочи сдается аналогично, материал берут чистыми приспособлениями и кладут в стерильный контейнер. Если нужно исследовать мазок либо соскоб, тогда следует исключить половую связь за несколько суток до мероприятия, в том числе и спринцевания. Воздержитесь от сдачи анализа в период месячных и еще на протяжении двух дней после их окончания.

Проведение анализа пцр

Выполняется данное исследование в лабораторных условиях. Мероприятие состоит из нескольких этапов:

  1. Забор материала выполняется в кабинете медицинского учреждения. Все оборудование и принадлежности должны быть стерильными.
  2. Материал хранится под определенной температурой, не дольше двух часов по времени. При более продолжительном сбережении пробирка помещается в холодильник. Если нужно сохранить материал на две недели, тогда его замораживают. Перевозится в специально отведенных для этой цели контейнерах.
  3. Выделение ДНК. Все зависит от типа интересующего представителя патогенной флоры. Применяются методики твердофазной сорбции и др.
  4. Материал помещают в специальную центрифугу. Автоматически делается амплификация. Длится манипуляция от двух до трех часов. Число циклов колеблется от 30 до 40-ка.
  5. Фиксирование полученных данных. Фрагменты выделяются способом электрофореза. Образцы изучаются в ультрафиолетовом свечении. Появление оранжевой полосы говорит о позитивном результате.
  6. Трактовка полученных данных. Бывает положительной и отрицательной, количество интерпретирует доктор. На его основании делают выводы о прогрессировании болезни, и определяется тактика лечения.

Где и для чего используется

Анализ днк методом пцр применяется в самых разных сферах. Сегодня это один из самых популярных диагностических способов, который является приоритетным:

  • в гинекологии. Позволяет определить ряд инфекций: ВПЧ, хламидиоз, гарднереллы и многое другое. Обнаружение вирусов и инфекций позволяет предпринять своевременно меры по предотвращению рака шейки матки;
  • в неонатологии. Известно множество патологий, которые способны вредить плоду еще в материнской утробе;
  • в службе крови. Пациенты с тяжелыми диагнозами типа сифилиса, ВИЧ и др., проходят пцр диагностику. Она определяет даже скрытые инфекции, которые невозможно выявить с помощью обычных серологических методов;
  • при подозрении инфекций, также делается пцр анализ на зппп. С помощью него удается выявить вирусы гепатита, нередко назначают делать анализ пцр на вич и другие инфекции;
  • в пульмонологии назначается при подозрении на воспаление легких, наличие бронхитов. Делается также анализ крови пцр на туберкулез, что позволяет определить недуг на начальном этапе развития.

В мед учреждениях обычно предлагается комплексный пцр анализ для определения целых групп инфекций.

Пцр анализ при беременности

В период вынашивания любой недуг может негативно повлиять на внутриутробное развитие плода. Чем быстрее врачу удастся определить возбудителя, тем быстрее можно будет назначить эффективную тактику терапии. Нельзя ждать и использовать малоинформативные методы, так как это может привести к прогрессированию заболевания и даже гибели ребенка.

Анализ пцр у мужчин

Мазок у мужчин чаще всего берут из мочеиспускательного канала. Необходимо его сдать в случае подозрения на наличие инфекций, заболеваний с вялотекущей клиникой, а также в случае обнаружения патологий у партнерши.

Предпосылками для назначения данного исследования служат:

  • наличие выделений;
  • болезненные ощущения при мочеиспускании;
  • покраснения и отеки;
  • сыпь;
  • постоянные позывы в туалет;
  • воспаления мочеполовой сферы;
  • подозрения на любые зппп;
  • проблемы с репродуктивной функцией;
  • профилактика.

Сдают такой анализ по рекомендации доктора.

Пцр анализ: цена

Стоимость зависит от того, на какой именно тип инфекции человек желает провериться. Также есть два способа проведения исследования: качественная и количественная методика. К тому же в разных клиниках действует своя ценовая политика, которую необходимо уточнять.

Полимеразная цепная реакция

Генетика бактерий. Информация для второго занятия.

Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция – метод, позволяющий провести многократное увеличение (амплификацию) количества определенных молекул ДНК в анализируемом образце (в том числе в биологическом материале или чистой культуре).

Главные преимущества ПЦР как диагностического метода в микробиологии – очень высокая чувствительность, позволяющая обнаружение крайне малых концентраций возбудителей в образцах, а такжерегулируемая специфичность, позволяющая обнаруживать или идентифицировать возбудителей на родовом, видовом или субвидовом уровне. Основной недостаток ПЦР вытекает из его крайне высокой чувствительности – образы очень легко загрязнить ДНК из положительного контроля, другого образца или продукта ПЦР, что приведет к ложноположительной реакции. Это накладывает жесткие ограничения на условия, в которых производится смешивание ПЦР и работа с готовыми продуктами ПЦР.

Проведение ПЦР. Готовится реакционная смесь, содержащая следующие компоненты:

Выделенную ДНК из исследуемого образца,

Ионы Mg2+ (необходимы для работы фермента),

Два праймера – одноцепочечныекороткие молекулы ДНК (длина чаще всегоот 18 до 24 нуклеотидов), комплементарные концам разных цепей обнаруживаемой последовательности ДНК.

Термостойкую ДНК-полимеразу (чаще всего используется Taq-полимераза – полимераза, выделенная из Thermus aquaticus ).

Затем данная реакционная смесь помещается в амплификатор, который фактически представляет собой программируемый термостат. В амплификаторе проводится 30-40 циклов смены температур. Каждый из этих циклов состоит из трех этапов (см. Рис. 1):

Денатурация (температура 94 о С) – разрываются водородные цепи, и цепочки ДНК расходятся.

Отжиг праймеров (температура обычно в районе 50-60 о С) – к концам цепей ДНК присоединяются праймеры. Вообще, при снижении температуры энергетически выгоднее воссоединение исходных цепей ДНК из исследуемого образца (ренатурация), однако концентрация праймеров в реакционной смеси на много порядков больше концентрации ДНК из образца (по крайней мере, на начальных циклах ПЦР), поэтому реакция отжига праймеров протекает быстрее ренатурации ДНК. Температура отжига выбирается в зависимости от температур плавления (денатурации) праймеров.

Элонгация (температура обычно 72 о С) – ДНК-полимераза достраивает праймеры по матрице длинных цепей ДНК. Температура соответствует оптимальной температуре работы используемой ДНК-полимеразы.

Детекция результатов отличается в различных вариантах постановки ПЦР и описана в разделе «Разновидности ПЦР».

На ранних циклах ПЦР количество двухцепочечных молекул ДНК, размер которых определяется расстоянием между местами посадки праймеров, удваивается с каждым циклом. Также образуется малое количество более длинных молекул ДНК, которым можно пренебречь (см. Рис 2).

Таким образом, на ранних циклах количество продукта ПЦР описывается формулой m*2 n , где m – исходное количество искомой ДНК в пробе, n – число циклов. Затем реакция выходит на плато. Это происходит из-за накопления продукта реакции, снижения концентрации праймеров и дезоксинуклеотидтрифосфатов, а также за счет повышения концентрации пирофосфата (см. Рис 3).

В данном варианте постановки ПЦР реакция идет заранее выбранное число циклов (30-40), после чего анализируется, произошло ли накопление двуцепочечных молекул ДНК в реакционной смеси.

Данный вариант постановки ПЦР при использовании в качестве способа диагностики является качественным методом. Положительная реакция свидетельствует о наличии хотя бы следовых количеств искомых молекул ДНК в образце. Отрицательная реакция свидетельствует об их отсутствии. Количественная оценка содержания исходных молекул ДНК в образце невозможна из-за выхода реакции на плато.

Основным методом выявления наличия продукта является электрофорез в агарозном или полиакриламидном геле. Продукты ПЦР разделяются в геле под действием электрического поля в соответствии с их молекулярной массой. В гель добавляется интеркалирующий краситель (флуоресцирующий в связанном с двухцепочечной ДНК состоянии — чаще всего бромистый этидий). Таким образом, при облучении ультрафиолетом можно будет увидеть наличие или отсутствие полоски, соответствующей ДНК необходимой молекулярной массы. При проведении ПЦР в диагностических целях всегда ставятся положительный и отрицательный контроли реакции, с которыми сравниваются образцы (см. Рис. 4).

ПЦР в реальном времени

В данном варианте постановки ПЦР количество продукта ПЦР в реакционной смеси регистрируется постоянно в ходе протекания реакции. Это позволяет построить кривую протекания реакции (см. Рис. 3) и, исходя из неё, рассчитать количество искомых молекул ДНК в образцах.

Один из видов проведения ПЦР в реальном времени – с использованием интеркалирующегокрасителя, который добавляется прямо в реакционную смесь (чаще всего используется SYBRGreen). Другой вид – с использованием одного из видов флуоресцирующих зондов, связывающихся с участком внутри ПЦР-продукта, что позволяет повысить специфичность обнаружения (см. Рис 5).Детекцияфлуоресценции происходит непосредственно в приборе в ходе протекания реакции.

Помимо возможности количественного обнаружения, существуют и другие достоинства ПЦР в реальном времени по сравнению с конвенциональной. Данный вариант ПЦР более прост, быстр, а также не требует открывания пробирок с продуктами ПЦР, что уменьшает вероятность загрязнения других образцов. Основной недостаток – более высокая стоимость амплификатора со встроенной возможностью детекциифлуоресценции по сравнению с обычным.

Цифровая количественная ПЦР

Новый, дорогостоящий и пока малораспространенный вариант ПЦР, позволяющий более точно определять количество ДНК в образце.В данном варианте реакционная смесь, содержащая флуоресцентный краситель, разбивается на огромное число микроскопических объемов (например, капелек в эмульсии). После протекания ПЦР анализируется, в какой доле капелек реакция оказалась положительной и, соответственно, наблюдается флуоресценция. Эта доля будет пропорциональна числу искомых молекул ДНК в образце.

ПЦР с обратной транскрипцией

В данном случае перед тем или иным вариантом ПЦР производится реакция обратной транскрипции (РНК в ДНК) с использованием фермента ревертазы. Таким образом, этот метод позволяет проводить качественное или количественное обнаружение молекул РНК. Это может использоваться для детекции РНК-содержащих вирусов или определения уровня транскрипции (количества мРНК) того или иного гена.

Рисунок 1. Этапы ПЦР. Красным цветом обозначены праймеры.

Рисунок 2.Накопление двуцепочечных молекул ДНК, ограниченных праймерами, в ходе ПЦР.

Рисунок 3.Динамика реакции ПЦР при разных изначальных концентрациях искомых молекул ДНК в пробе. (а) – наибольшая концентрация (б) – промежуточная концентрация (в) – наименьшая концентрация

Анализ ПЦР: суть метода и его преимущества

Анализ ПЦР – современный и высокоточный метод диагностики, позволяющий выявлять возбудителя инфекции независимо от стадии патологии. На сегодня этот способ обследования признан наиболее достоверным, так как он исключает получение ложных данных благодаря высокому уровню специфичности.

Суть метода ПЦР

Анализ ПЦР – полимеразная цепная реакция, позволяющая многократно увеличить объем микробной среды и определить возбудителя. Явление ПЦР было открыто в 20 веке американским ученым Кэри Мюллисом, благодаря которому в разы сократилось время постановки точного диагноза, а следовательно, врачи стали быстрее назначать адекватные терапевтические мероприятия.

Суть анализа ПЦР заключается в многократном увеличении фрагментов ДНК возбудителя, полученного из биологических проб пациента (мочи, крови, слюны и других). Эта методика позволяет увеличить в искусственной среде определенные участки генетического материала при помощи специальных ферментов, к тому же количество исследуемых фрагментов растет до такой степени, что можно их визуально исследовать.

Стоит отметить, что при анализе ПЦР копируются только определенные участки, играющие важную роль в диагностике. Если они присутствуют в организме пациента в ничтожно малом количестве, то этот анализ сможет их выявить.

Методика ПЦР активно используется в медицинской практике для изучения инфекционных и наследственных заболеваний, ведь помимо простого увеличения количества генетического материала (амплификации), он позволяет сращивать отдельные фрагменты ДНК и вводить мутации, осуществляя контроль за генами, которые вызывают опасения.

Что выявляет анализ ПЦР

Анализ ПЦР широко применяется в различных сферах медицины. Конечно, чаще всего он используется в гинекологии и урологии, но методика актуальна и для пульмонологии, фтизиатрии, гастроэнтерологии, онкологии и других областей.

Анализ ПЦР позволяет выявить вирусы на различных стадиях заболевания, также он способен выявить скрытые или «спящие» микроорганизмы, которые не вызывают появления клинических признаков:

  • Вирус папилломы человека разных типов (ВПЧ);
  • Хламидии;
  • Трихомонады;
  • Возбудителя гонореи;
  • Микоплазмы;
  • Уреаплазмы;
  • Гарднереллы;
  • Грибы кандида;
  • Микробактерии туберкулеза;
  • Вирусы гепатита А, В и С;
  • Хеликобактерии;
  • ВИЧ;
  • Вирусы герпеса;
  • Цитомегаловирусы (ЦМВ);
  • Вирусы Эпштейна-Барра.

Преимущества анализа ПЦР

  1. Высокая точность анализа: риск получения ложноотрицательных результатов минимален;
  2. Специфичность методики: анализ ПЦР позволяет выделить конкретный возбудитель инфекции, его вид и тип;
  3. Повышенная чувствительность: анализ ПЦР определяет даже несколько фрагментов ДНК микроорганизма;
  4. Возможность исследования разных биологических сред организма;
  5. Скорость получения результатов: их можно получить через 4-5 часов после процедуры;
  6. Возможность выявления нескольких микроорганизмов из одной пробы биологического материала.

Анализ ПЦР активно используется врачами разных специальностей, при этом отодвигаются на второй план другие методы диагностики. Стоит отметить, что эта процедура позволяет выявить носителей инфекции и латентные формы болезни, при которых нет клинических проявлений, но эти возбудители негативно отражаются на общем состоянии организма и его функциональности, а пациенты представляют опасность для окружающих.

Подготовка и проведение анализа ПЦР

Фрагменты ДНК микроорганизмов находятся в разных биологических средах пациента. Врачи сами определяют области взятия материалов для анализа ПЦР, которые зависят от типа заболевания и его локализации. Если вы обратились к венерологу с целью выявления инфекций, передающихся половым путем (ИППП), то будут исследованы выделения из половых органов (мазок или соскоб с шейки матки, влагалища) и мочеиспускательного канала, а также кровь и моча.

Герпетические инфекции и мононуклеоз диагностируются на основании анализа мазков из полости рта пациента. ЦМВ подтверждается после обследования мочи, спинномозговой жидкости. В отделении пульмонологии для анализа ПЦР берут мокроту и содержимое плевральной полости. У беременных при подозрении на внутриутробные инфекции плода исследуют околоплодные воды и ткани плаценты.

Чтобы исключить вероятность ошибочных результатов и повысить точность анализа ПЦР, перед сдачей биологического материала следует придерживаться несложных рекомендаций:

  • Большая часть микробов вымывается вместе с мочой, поэтому перед взятием мазка из уретры не стоит мочиться;
  • В течение 3-5 суток следует воздержаться от половых отношений;
  • Анализ ПЦР не проводится сразу после прекращения менструальных выделений, следует подождать 5-7 дней;
  • За 4 часа до сдачи слюны необходимо отказаться от приема лекарственных препаратов и пищи, а перед процедурой рекомендуется прополоскать рот водой и провести легкий массаж в области щек;
  • Мочу следует собирать в утренние часы в стерильный контейнер, для исключения загрязнения материала перед его взятием следует подмыться, женщинам ввести стерильный тампон во влагалище, а мужчинам максимально оттянуть складку крайней плоти;
  • За сутки до сдачи материала надо воздержаться от приема алкоголя, острой пищи и горячих процедур (сауны, бани и т.п.);
  • За 2 недели до анализа ПЦР необходимо прекратить прием антибактериальных средств;
  • За неделю до обследования приостанавливают использование интимных гелей, мазей и вагинальных свечей.

Это довольно простые правила, но они помогут получить максимально достоверные результаты и снизить риск ошибок в диагностике.

Расшифровка анализа ПЦР

Результаты анализа ПЦР могут быть положительными или отрицательными. Отрицательный результат исследования свидетельствует об отсутствии инфекции в биологических материалах.

Положительный результат подтверждает наличие микроорганизмов, но для постановки точного диагноза необходимы сведения об их количестве. Ведь в нашем организме присутствуют условно-патогенные микробы, которые становятся причинами заболеваний только в результате активного роста и размножения. Основываясь на количественных данных анализа ПЦР, врач может выяснить стадию развития патологического процесса, его активность, подобрать специфическое лекарственное средство и его дозировку.

Анализ ПЦР во время беременности

Беременность – это особенный период в жизни каждой женщины. В это время многие ИППП или латентные инфекции могут быть крайне опасными для малыша и вызвать преждевременные роды, выкидыш, пороки и аномалии развития. Поэтому анализ ПЦР проводят всем беременным в плановом порядке преимущественно на ранних сроках (до 12 недель), но иногда назначают и во время 2 триместра.

Материал берут из канала шейки матки и уретры, процедура безболезненная и не представляет угрозы. В большинстве случаев, анализ ПЦР проводят по поводу хламидий, уреаплазм, микоплазм, цитомегаловируса, герпеса и ВПЧ. Именно эти микроорганизмы представляют угрозу во время беременности. Но иногда женщины проходят комплексный анализ ПЦР, который включается в себя исследование на большое количество микроорганизмов (12 и более).

Что такое анализ ПЦР: преимущества и расшифровка

Полимеразная цепная реакция – метод диагностики, разработанный более 30 лет назад. Технология применяется в самых разных областях: от археологии до генетики. С помощью данных можно установить отцовство, но чаще всего способ используется для выявления инфекционных патологий в организме пациента. Разберемся подробно, что такое ПЦР, как проводится ПЦР-исследование, когда и для чего назначается.

Анализ ПЦР – что это такое?

Высокоинформативная точная методика диагностирования заболеваний, вызванных вирусами, патогенными и бактериальными агентами – это ПЦР анализ. Являясь одной из самых современных, диагностика обладает массой преимуществ перед другими методами. Доступность способа, максимально высокий уровень специфичности, верность результатов, отсутствие ложных или непонятных определений – параметры, которые характеризуют анализы ПЦР.

ПЦР диагностика способна в несколько раз увеличить нужный участок ДНК бактерии или иного возбудителя в материале, забранном для исследования.

Преимущество метода

Зная, что такое анализ ПЦР, разберемся в положительных качествах исследования:

  1. высокая чувствительность для выявления агентов заболевания;
  2. выявление бактерий в различных биологических материалах;
  3. вычисление как единичных, так и множественных микроорганизмов, выступающих причиной заболевания;
  4. возможность транспортировки биологического материала – методика также хорошо работает с «мертвым» возбудителем;
  5. оперативность получения результатов;
  6. высокая точность этиологической диагностики;
  7. определение количественного уровня патогенных микроорганизмов – крайне важно в случаях, когда условно-патогенные бактерии могут создавать угрозу для здоровья, накапливаясь до определенного количества.

Метод ПЦР позволяет осуществлять своевременный контроль за течением процесса при осуществлении лечения. Это помогает корректировать воздействие, подбирая необходимый вариант терапии.

Важно! Метод диагностики выявляет возбудителя инфекции непосредственно в гене – сегодня это самый точный анализ на половые, скрытые и прочие инфекции.

Разновидности ПЦР

Сегодня существуют следующие методики проведения анализа:

  • с обратной транскрипцией – используется для значительного увеличения и идентификации последовательности из библиотеки ДНК/РНК;
  • инвертирование – применяется в случаях известности малого участка внутри нужной последовательности;
  • вложенный ПЦР – рекомендуется при снижениях количества побочных продуктов реакции;
  • ассиметричный – метод подходит при выделении одной цепи исходной ДНК;
  • количественный или ПЦР в реальном времени – проведение показано для наблюдения за измерением количества конкретного ПЦР в каждом цикловом отрезке реакции;
  • ступенчатый ПЦР-анализ уменьшает влияние неспецифического связывания праймеров;
  • групп-специфический – это исследование для родственных последовательностей одного или разных видов с использованием консервативных праймеров.

При неизвестности нуклеотидной последовательности матрицы или частичной известности, допускается применение вырожденных праймеров.

Какие инфекции позволяет выявить ПЦР?

Благодаря широкому спектру применения метода, диагностика выявляет как открытые, так и скрытые инфекции, никак себя не проявляющие. В частности:

  • гепатиты;
  • уреплазмоз;
  • кандидоз;
  • хламидиоз;
  • папиллома вирус;
  • герпес;
  • раковые клетки;
  • вагиноз бактериального типа;
  • мононуклеоз инфекционного типа;
  • трихомониаз;
  • гормональное состояние;
  • СПИД (ВИЧ).

Важно! Зная, что такое анализ на ПЦР, следует помнить: для забора проб требуется подготовка. Медики советуют проводить исследование на вензаболевания не позднее суток после полового акта.

Какие биологические материалы исследуются?

Если назначен ПЦР анализ, что это значит и откуда берется биоматериал? Диагностика требуется для проведения исследований на выявление чужеродной ДНК из следующих биологических сред и жидкостей человека:

  • Урина. При инфекционном поражении мочеполовой системы. У мужчин моча заменяет эпителиальный соскоб.
  • Мокрота. Берется при подозрении на туберкулез, хламидиоз и микоплазмоз респираторной формы.
  • Сок простаты, плевральная, спинномозговая, околоплодная, суставная и прочие биологические жидкости собираются по показаниям.
  • Эпителиальный соскоб слизистой. Диагностирование заболеваний половой сферы (ЗППП), поражающих слизистые оболочки.
  • Биопаты желудка и двенадцатиперстной кишки. Для выявления бактерии хеликобактер.
  • Кровь, плазма, сыворотка. Анализ на гепатиты, герпес, ВИЧ, исследование генов пациента.

Как подготовиться к сдаче анализа?

Достоверность результатов напрямую зависит от выполнения рекомендаций по сдаче материала. Подготовка требует стерильности биоматериалов, основные правила такие:

  1. Моча собирается в специальный контейнер утром натощак;
  2. Забор крови должен проводиться только на голодный желудок, с утра;
  3. Если нет необходимости сдавать анализы на ЗППП, то от половой жизни за сутки до забора проб следует оказаться.

Понимая, что такое ПЦР диагностика, не следует относиться к подготовке небрежно: обследование выдает максимально точные результаты, поэтому грязные материалы к исследованию не допускаются. Получение результата зависит от сложности процедуры.

Расшифровка анализа ПЦР

Процесс интерпретации результатов простой:

  1. Если поставлен отрицательный маркер – это значит, что заболевание исключено, в исследуемом материале инфекционный возбудитель отсутствует.
  2. Положительный ПЦР – обследование выявило ДНК или РНК возбудителя инфекции.

Иногда расшифровка дополняется количественным определением. Информация актуальна для болезней, вызываемых условно-патогенными штаммами. Они провоцируют развитие патологии только при превышении стандартного количества колоний. Кроме того, количественная реакция необходима тогда, когда проводится определение терапевтической тактики лечения и нужен контроль клинической картины патологии.

Где сдать анализ, и в какие сроки он готовится?

Оперативность предоставления протокола конкретного исследования зависит от вида инфекции. Некоторые результаты готовы в тот же день, а вот ИППП, вирус папилломы, герпеса – 1 день, гепатит – до 5 суток. Медики рекомендуют делать диагностику пакетом – это намного выгоднее в ценовом отношении.

Услугу предоставляет большинство клиник, в том числе онкологические центры, где обязательно проводится забор на анализ ПЦР, что это такое, вы теперь знаете.

Что такое ПЦР?

Полимеразная цепная реакция, ПЦР (англ. — PCR — polymerase chain reaction) не сходит с заголовков статей научных журналов с тех пор, как была открыта Кэри Б. Мюллисом в 1983 году, за что он был удостоен Нобелевской премии.

ПЦР — это метод, который позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой участок генетической информации (ДНК) инфекционного возбудителя и многократно размножить его.

В диагностике инфекций передаваемых половым путем (ИППП) также используются следующие методики:

  • микроскопия — исследование неокрашенных и окрашенных препаратов в светооптическом микроскопе. Точность метода зависит от опыта врача-лаборанта. Как правило хорошо диагностируются гонококки, трихомонады, гарднереллы и кандиды (бактерии больших размеров). Другие инфекции не видны под микроскопом, так как очень маленького размера.
  • бактериология — культивирование (выращивание) инфекций на питательных средах. До практического использования ПЦР, бактериальное исследование считалось «золотым стандартом» в диагностике ИППП, т. е. самым точным методом. Большим плюсом данной методики является возможность определения чувствительности микробов к антибиотикам. Минусом — необходимость быстрой доставки клинического материала в лабораторию, пока микробы не погибли в окружающей среде, не все ИППП растут на питательных средах, необходимость использования качественных питательных сред, сроки получения результатов — 5 — 7 дней.
  • иммуноферментный анализ — определение специфических антител (белков), вырабатываемых в ответ на внедрение микробов (антигенов) в сыворотке крови. То есть выявляют не сам микроб, а антитела которые вырабатывает организме человека. Плюсом метода является возможность определение стадии инфекционного процесса (в острой стадии определяются иммуноглобулины (антитела) класса М, в хронической — иммуноглобулины класса G). Минусом — отсутствие выработки антител у пациентов с иммунодефицитом, перекрестная реакция антител со схожими микробами, низкие показатели чувствительности и специфичности. На основании результатов только ИФА без подтверждения другими методами диагностики и при отсутствии клинических проявлений выставлять диагноз не представляется возможным.

Анализ ПЦР

На сегодняшний день анализ ПЦР считается одним из самых достоверных методов диагностики различных инфекционных заболеваний. К тому же метод становится всё более доступным. Благодаря высокому уровню специфичности исключается возможность получения ложных результатов.

Методика проведения анализа

Во время анализа исследуемый материал помещают в специальный прибор. Добавляют ферменты, которые участвуют в образовании генетического материала. Далее происходит многократное копирование ДНК или РНК возбудителя заболевания. От цикла к циклу число копий ДНК возрастает до количества, при котором легко идентифицировать возбудитель.

Анализ крови методом ПЦР наиболее часто используют в клинической практике для выявления инфекционной причины заболевания. Также возможно исследование мочи, мазка из зева и других биологических материалов. У женщин для анализа ПЦР используют выделения из половых органов, мазок из уретры, цервикального канала. При этом важно знать, как подготовиться к анализу ПЦР у женщин, чтобы результат был максимально достоверный. Главное соблюдать нижеперечисленные правила:

  • воздержание от половых актов в течение трех суток перед сдачей анализов;
  • большая часть бактерий может «вымыться» с мочой, поэтому не следует мочиться перед исследованием;
  • не проводить исследование сразу после менструации, необходимо подождать 3-5 дней после ее окончания.

Перед анализом крови особой подготовки нет.

ПЦР – что показывает анализ?

Известно, что анализ ПЦР показывает наличие различных вирусных и бактериальных инфекций. Данный метод также эффективен для выявления скрытых, хронических инфекций. Анализ на ИППП методом ПЦР дает возможность выделить патогенный агент даже при наличии единичных клеток вирусов и бактерий. Стоит отметить, какие анализы ПЦР входят в блок генитальных инфекций, это:

  • хламидия;
  • микоплазмы;
  • уреаплазмы (парвум и уреалитикум);
  • возбудитель гонореи;
  • различные типы вируса папилломы человека;
  • трихомонады;
  • гарднереллы;
  • кандида.

При инфекционных заболеваниях половых органов материалом для ПЦР служит мазок из цервикального канала, уретры и влагалища. К подготовке к зачатию следует подходить с большой ответственностью. При планировании беременности необходимы анализы ПЦР в случае, когда есть подозрения на наиболее распространенные инфекционные заболевания. А при наличии инфицированности беременность лучше отложить. Стоит отметить, что анализы на выявление вышеперечисленных возбудителей необходимо сдать не только женщине, но и мужчине.

Также метод ПЦР позволяет выявить следующие возбудители:

  • вирусы гепатита В и С;
  • микобактерии туберкулеза;
  • ВИЧ;
  • вирусы семейства герпес, в том числе вирус Эпштейн-Барр и цитомегаловирус;
  • хеликобактерная инфекция.

Интерпретация результатов

Расшифровка анализа ПЦР не вызывает сложностей. Обычно результаты анализов ПЦР можно получить следующие:

  1. Отрицательный результат означает, что в исследуемом материале не обнаружено искомого инфекционного возбудителя.
  2. Положительный результат свидетельствует о наличии ДНК или РНК возбудителя. То есть с большой уверенностью можно утверждать, что именно выявленный микроорганизм является причиной заболевания.

В некоторых случаях производят количественное определение микроорганизмов. Это особенно актуально при заболеваниях, вызванных условно-патогенными микроорганизмами. Так как данные бактерии проявляют свое негативное воздействие лишь при избыточном количестве. Также количественный анализ ПЦР важен для выбора терапевтической тактики и с целью контроля над лечением таких вирусных инфекций, как ВИЧ и вирусы гепатита.

Анализ ПЦР

ПЦР (метод полимеразной цепной реакции) — экспериментальный метод, использующийся при лабораторной диагностике многих инфекционных заболеваний и позволяющий обнаружить большинство микроорганизмов.

С помощью этого анализа можно выявить и идентифицировать в биоматериале следы различных микроорганизмов, даже если они присутствуют в очень малых количествах.

Метод полимеразной цепной реакции был открыт и впервые использован в 1983 г. В 1993 году создатель анализа ПЦР был награжден Нобелевской премией за бесценный вклад в развитие медицины.

Акция для женщин: Комплексная диагностика ПОЛОВЫХ ИНФЕКЦИЙ Полная стоимость комплексного обследования по прейскуранту — 4090 рублей. Цена со скидкой — 3500 рублей

Суть метода полимеразной реакции

У каждого живого организма имеется свой уникальный набор хромосом. Ни у одного существа он не повторяется, но все хромосомы образованы ДНК — дезоксирибонуклеиновой кислотой. ДНК состоит из множества мельчайших молекул, называемых нуклеотидами.

Последовательности цепочек этих молекул образуют гены. Гены же отвечают за кодировку синтеза огромного количества белков, таких, как глобулин, коллаген и т. д.

Последовательность нуклеотидов у каждого организма уникальна, за исключением схожих участков ДНК, отвечающих за относительное однообразие в пределах вида организма. Методом ПЦР находят фрагменты нуклеиновой кислоты и определяют, какому виду микроорганизма они принадлежат.

Но анализ ДНК небольшого количества микробов будет малоинформативен. Чтобы иметь возможность выявить и исследовать определенные видовые закономерности, необходимо увеличить количество нуклеотидов во много сотен раз. Для этого также используют методику ПЦР.

Чтобы получить достаточное количество материала для проведения исследования, к ДНК микроорганизма добавляют определенные нуклеотиды, а также ДНК-полимеразу. Этот фермент обеспечивает многократное копирование интересующего исследователей участка.

Катализатором (веществом, запускающим реакцию) процесса служат нити РНК, крепящиеся к гену, который и необходимо изучить. За несколько часов анализа всего из одного нуклеотида можно получить достаточное количество материала для исследований.

Этапы анализа

  1. Сбор и доставка в лабораторию биоматериала человека (слюны, крови, мочи или любой другой биологической жидкости).
  2. Очищение нужной хромосомы и разделение двух образующих ее нитей ДНК.
  3. Выделение требующегося нуклеотида и дальнейшее его удвоение. Далее количество копируемого материала стремительно увеличивается в геометрической прогрессии.
  4. Разделение участков ДНК реакцией электрофореза, обработка растворами, вызывающими свечение или изменение цвета ДНК. Анализ устанавливает вид искомого микроорганизма.

Длительность анализа ПЦР обычно составляет от трех до пяти часов, но результаты приходят в клинику не ранее, чем через сутки.

Преимущества метода ПЦР

На данный момент метод ПЦР — один из лучших способов определения возбудителей инфекции по нескольким причинам:

  1. Специфичность — определение конкретного вида возбудителя, что облегчает подбор лечения.
  2. Высокая точность за счет определения ДНК возбудителя, а не выявления антител, вырабатываемых организмом.
  3. Минимум биоматериала. Для диагностики хватает количества материала в сотни раз меньшего, чем требуется при других анализах.
  4. Возможность проанализировать практически любой биоматериал. Обнаруживает следы возбудителя в биологических жидкостях и в других клетках организма.
  5. Возможность диагностировать бессимптомные инфекции.
  6. Высокая скорость получения результатов анализа.
  7. Автоматизация процесса диагностики.
  8. Исключение контакта посторонних с биоматериалом, что, в свою очередь, исключает возможность заражения.

Недостатки метода ПЦР

Проблемы в основном связаны с технической сложностью процесса:

  1. Необходим правильный подбор РНК для катализации процесса и приготовление подходящей смеси нуклеотидов.
  2. Из-за крайне высокой чувствительности при инфицировании сразу несколькими микроорганизмами метод может дать неверный результат.
  3. Необходимость сравнения биообразцов с препаратами, в которых заведомо находится ДНК искомого микроорганизма.
  4. Для повышения точности диагностики необходимо как можно тщательнее очистить нити ДНК от любых посторонних примесей, что повышает сложность анализа.

Ложноположительные и ложноотрицательные результаты

Ошибки анализа обусловлены двумя факторами:

  1. Для ложноотрицательных результатов такой фактор — нарушение техники проведения анализа.
  2. Для ложноположительных — случайное совпадение нуклеотидов или применяемых при исследовании реактивов с ДНК микроорганизма.

Следует учитывать, что даже при идентификации микроорганизма не всегда можно с уверенностью сказать, послужил ли он причиной болезни. К сожалению, генетическая основа множества неинфекционных заболеваний все еще неизвестна, что делает невозможной диагностику многих патологий.

Показания для назначения исследования ПЦР

Назначение ПЦР-диагностики оправдано в случае инфекционных заболеваний и необходимости определить природу возбудителя.

Также метод ПЦР применяется при:

  • необходимости точной идентификации возбудителя;
  • диагностике некоторых генетических заболеваний;
  • анализе образцов биопсии, исследование которых стандартными методами невозможно;
  • необходимости идентификации личности путем сравнения части ДНК человека с биоматериалом заведомо известного происхождения;
  • диагностике злокачественных новообразований и лейкоза;
  • проведении генетических экспериментов с животными с заложенными еще до их рождения генетическими заболеваниями.

Также есть много возможных способов применения анализа ПЦР при проведении исследований в области медицины и биологии, от испытания степени эффективности лекарств уже на молекулярном уровне и до создания полностью автономных живых организмов с определенными свойствами.

На данный момент ПЦР-анализ применяется для диагностики достаточно обширного круга заболеваний, например:

  • Самых страшных заболеваний — ВИЧ-инфекции и гепатитов А, В, С, Е;
  • заболеваний, передающихся половым путем (ИППП);
  • туберкулеза;
  • внутриклеточных инфекций (вирусы, бактерии) и многих других болезней.

При подозрении на наличие ЗППП направление выдает гинеколог, уролог или андролог. При туберкулезе исследование назначает фтизиатр, а при подозрении на ВИЧ или вирусные гепатиты — инфекционист. Также для более точной постановки диагноза ПЦР используют онкологи, онкогематологи, генетики.

Подготовка к сдаче анализа

  • За 72 часа до сдачи биоматериала на ПЦР нужно полностью отказаться от употребления алкоголя. Также по назначению врачей могут быть отменены некоторые антибиотики.
  • За 48 часов необходимо исключить нагрузки. В день сдачи биоматериала запрещается принимать пищу, а также курить.
  • При необходимости сдачи материала на анализ из ротовой полости или носоглотки запрещается в день исследования чистить зубы.

При диагностике ЗППП:

  1. Не вступать в половой контакт 48 часов до анализа.
  2. Подмываться разрешено без любых гигиенических средств, последнее спринцевание не позже чем за 12 часов.
  3. За 2 часа до взятия биоматериала не мочиться.
  4. Запрещается сдавать анализ во время менструаций и на протяжении 4 дней после колоноскопии.

Точность и информативность диагностики будет зависеть от соблюдения этих несложных правил.

После получения результата исследования обязательно нужно обратиться к врачу, так как самостоятельная расшифровка медицинского заключения не даст достоверной информации о заболевании и методах его лечения.

Расшифровка результатов

Результат ПЦР всегда однозначен: он либо положительный, либо отрицательный. Отрицательный означает, что человек здоров, так как следов чужеродной ДНК не выявлено. Положительный же подразумевает наличие у человека фрагментов ДНК чужеродных микроорганизмов, что означает заражение. В таком случае требуется лечение.

Так как ПЦР является высокоточным методом диагностики, даже если пациент не чувствует недомогания и не замечает у себя никаких симптомов болезни, это не означает что он здоров — скорее это значит, что анализ просто выявил возбудителя на ранней стадии, пока тот еще не успел навредить организму.

Начало терапии в таком случае нельзя откладывать, ведь чем быстрее начнется лечение, тем легче удастся побороть болезнь.

ПЦР-диагностика обнаруживает микроорганизмы даже по единственной молекуле ДНК в пробе. Именно поэтому анализ ПЦР — наиболее эффективный диагностический инструмент, позволяющий выявить болезнь практически на любой ее стадии и контролировать ход ее лечения.

Ссылка на основную публикацию